Assassin's Creed: Bloodlines se déroule un mois après la fin des événements du premier Assassin's Creed, en automne 1191. Le jeu prend principalement place sur l'île de Chypre, dans deux de ses villes, Limassol et Kyrenia, où le joueur devient Altaïr, le personnage de Assassin's Creed . Altaïr est parti pour Chypre depuis la Terre Sainte (lieu de la première partie) afin de savoir pourquoi les Templiers y sont réunis, et d'assassiner les derniers d'entre eux. Bloodlines comprend plus de temps face à Maria, la femme membre des Templiers qui a été épargnée par Altaïr dans Assassin's Creed. L'antagoniste est Armand Bouchart, qui est devenu le Grand Maître de l'Ordre du Temple. Il cherche la « Pomme d'Éden », qui permet à l'utilisateur de contrôler l'esprit des gens et les plier à la volonté de quiconque utilise la Pomme. Altaïr doit l'arrêter, et empêcher d'autres dirigeants des Templiers notables comme Moloch « Le Taureau », Shalim et Shahar (fils de Moloch), Frederic « Le Rouge », et l'Oracle noir, d'utiliser l'autre Relique présente sur l'île pour atteindre leurs objectifs.