1190, la troisième croisade fait rage sur la Terre Sainte. Les Croisés se battent contre les Sarrasins pour le contrôle de Jérusalem, la Ville Sainte.

Un jeune assassin nommé Altair revient chez lui après un dur voyage et est chargé par ses aînés de trouver et rapporter un objet sacré : le Calice. Ce trésor aurait le pouvoir d’unir sous un même drapeau toutes les factions. Quiconque le posséderait, que ce soit les Croisés ou les Sarrasins, pourrait ainsi mettre un terme à la troisième croisade par la victoire d’un des deux camps. Mais le Calice est un objet bien trop puissant pour être laissé entre les mains des hommes : il doit être trouvé et détruit.

Cette préquelle d’Assassin's Creed intègre deux nouvelles villes par rapport à son prédécesseur, Tyr et Alep, et en supprime une, Masyaf. Elle délaisse également toute la partie « science-fiction » du premier opus.